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用內質網染色劑對活細胞進行染色 LumiTracker ER

更新時間:2024-03-14      點擊次數:83

LumiTracker ER Green 和 LumiTracker ER Red 具有細胞滲透性,對內質網 (ER) 染色劑具有高度選擇性,可用于活細胞成像。兩種 ER 染色劑都是 BDP 染料與格列本脲(格列本脲)偶聯的衍生物。格列本脲與 ATP 敏感鉀通道 (K ATP ) 的磺酰脲 (SUR) 受體結合,該受體在內質網上很突出。

用甲醛固定后,染色部分保留。 LumiTracker ER Green 和 LumiTracker ER Red 不適合對固定后的細胞進行染色。

注意:格列本脲的藥理活性可能會影響 ER 功能。某些特殊細胞類型中磺脲類受體的可變表達可能會導致非 ER 標記。

溶液的制備

1.1 庫存溶液的制備

  • 將 50 μg LumiTracker ER Green 溶解在 64 μL DMSO 中,以獲得 1 mM 儲備溶液。

  • 將 50 μg LumiTracker ER Red 溶解在 55 μL DMSO 中,以獲得 1 mM 儲備溶液。

注意:我們建議將儲備溶液儲存在?20°C或?80°C避光條件下。避免反復凍融循環。

1.2 工作液的配制

用鈣和鎂 (HBSS/Ca/Mg) 在 Hank's 平衡鹽溶液中稀釋 LumiTracker ER 染色劑的儲備溶液,以獲得工作溶液。使用 100 nM 至 1 μM 的濃度。 LumiTracker ER 染色劑的稀釋度取決于細胞類型和密度,應通過實驗確定。

細胞染色

2.1 懸浮細胞染色

  1. 1000 g離心細胞懸液 3-5 分鐘;棄去上清液。

  2. 用預熱的 HBSS 在 37°C 下清洗細胞兩次,每次 5 分鐘。

  3. 推薦的細胞密度為1×10 6 個細胞/mL。

  4. 將 1 mL 預熱的 LumiTracker ER 工作溶液添加到管中,并在 37 °C 和 5% CO 2下孵育細胞 15-30 分鐘。

  5. 室溫下以 400 g離心細胞 3-4 分鐘;棄去上清液。

  6. 用培養基清洗染色細胞兩次。

  7. 用無血清細胞培養基或 PBS 重懸細胞。

  8. 通過流式細胞儀分析細胞。

  9. 對于熒光顯微鏡,將一滴染色的細胞懸浮液轉移到載玻片上。用蓋玻片蓋住細胞。

2.2 貼壁細胞染色

  1. 在無菌蓋玻片上培養細胞。

  2. 貼壁細胞可以直接在蓋玻片上染色。

  3. 從蓋玻片中吸出介質。

  4. 用 37°C 預熱的 HBSS 沖洗細胞。

  5. 加入 100 μL 預熱的 LumiTracker ER 工作溶液,輕輕搖動以全覆蓋細胞。在 37 °C 和 5% CO 2下孵育細胞 15-30 分鐘。

  6. 用培養基清洗染色細胞兩次。

  7. 如果通過流式細胞術檢測,則需要在染色前重懸細胞。

  8. 對于熒光顯微鏡,將帶有染色細胞的蓋玻片翻轉到載玻片上,將它們放置在載玻片和蓋玻片之間。

細胞固定

  1. 如果要固定染色的細胞,請在 4% 甲醛中于 4 °C 下孵育 2 分鐘。

  2. 固定細胞用 PBS 清洗兩次,每次 5 分鐘。

  3. 使用封固劑將細胞封固在蓋玻片下 。



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