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使用 LumiZol 試劑快速分離 RNA、DNA 和蛋白質

更新時間:2024-03-14      點擊次數:62

LumiZol Reagent 設計用于從各種來源(植物、動物、細菌和酵母)的細胞和組織樣品中快速分離 RNA、DNA 和蛋白質。 LumiZol Reagent 是一種含有苯酚、異硫氰酸胍以及分離高質量核酸和蛋白質所需的其他成分的溶液。苯酚和異硫氰酸胍可裂解細胞并有效抑制核糖核酸酶,從而保持 RNA 完整。均質化并添加氯仿后,樣品分離成上層水相、中間相和下層有機相。 RNA 可以用異丙醇從上相沉淀,而 DNA 和蛋白質可以分別用乙醇和異丙醇從中間相和下層有機相沉淀。

用于 RNA、DNA 和蛋白質分離的樣品:

  • 植物和動物組織——30-100毫克;

  • 貼壁真核細胞 — 1×10 5至 1×10<sup7< sup="" style="box-sizing: border-box;">;

  • 懸浮真核細胞、酵母 — 5×10 6至 10×10 6;

  • 細菌細胞 — 1×10 7。


RNA分離

使用新鮮或液氮速凍樣品以獲得最佳 RNA 分離效果。在 LumiZol 試劑中均質化之前,請勿解凍樣品。

  1. 根據您的起始材料在 LumiZol 試劑中裂解樣品:

    • 組織:在 1 mL LumiZol 試劑中勻漿組織樣本,并將勻漿轉移至新的 1.5 mL 管中。

    • 細胞:棄去培養基,用 0.5–1 mL LumiZol 試劑重懸細胞沉淀或單層細胞,然后將裂解物轉移至新的 1.5 mL 試管中。

  2. (可選)如果樣品脂肪含量高,則將裂解液在 4 °C 下以 12,000 × g 離心 5 分鐘,然后將上清液轉移至新的 1.5 mL 管中。

  3. 將管在室溫下孵育 5 分鐘。

  4. 向裂解液中添加 0.2 mL 氯仿(每 1 mL 用于裂解的 LumiZol 試劑),通過翻轉管充分混合,并在室溫下孵育 2 分鐘。

  5. 將管在 4°C 下以 12,000 × g 離心 15 分鐘。離心后,混合物分成兩相:無色水相和黃色有機相,其間有中間相。

  6. 將上層水相轉移至新的 1.5 mL 管中,不要接觸間相。如果樣品中RNA的量非常少,則在水相中添加共沉淀劑。保留有機相和界面用于 DNA 和蛋白質提取。

  7. 向水相中加入0.8體積的異丙醇,充分混合,并在室溫下孵育10分鐘。

  8. 將管在 4°C 下以 12,000 × g 離心 10 分鐘。

  9. 棄去上清液,向 RNA 沉淀中加入 1 mL 70% 乙醇,充分混勻,并在 4 °C 下以 7,500 × g離心管 5 分鐘。

  10. 棄去上清液,將 RNA 沉淀風干 5-10 分鐘。

  11. 將 RNA 沉淀溶解在 50–100 μL 無 RNase 水中。

DNA分離

  1. 除去“RNA 分離"部分步驟 5 中獲得的界面上的任何剩余水相。

  2. 向界面相和有機相中添加 0.3 mL 100% 乙醇(每 1 mL 《RNA 分離》步驟 1 中使用的 LumiZol 試劑),通過翻轉管混合,并在室溫下孵育 2-3 分鐘。

  3. 將管在 4 °C 下以 2,000 × g 離心 5 分鐘。將上清液轉移至新的 1.5 mL 管中。上清液可用于后續的蛋白質提取。

  4. 將 DNA 沉淀重懸于 1 mL 檸檬酸鈉/乙醇溶液(10% 乙醇中的 0.1 M 檸檬酸鈉,pH 8.5)中。

  5. 孵育 30 分鐘,偶爾混合。

  6. 將管在 4 °C 下以 2,000 × g 離心 5 分鐘。丟棄上清液。

  7. 再重復一次步驟 4-6。

  8. 將 1 mL 70% 乙醇添加到 DNA 沉淀中,充分混勻,然后在 4 °C 下以 2,000 × g離心管 5 分鐘。

  9. 棄去上清液,將 DNA 沉淀風干 5-10 分鐘。

  10. 將 DNA 沉淀重懸于 0.3–0.6 mL 的 8 mM 氫氧化鈉中。

  11. 將管在 4 °C 下以 12,000 × g 離心 10 分鐘,將上清液轉移至新的 1.5 mL 管中,并用 Tris-HCl 緩沖液將 pH 調節至 7–8 [添加 5 μL 1 M Tris-HCl 緩沖液(pH 4.5)至300μL DNA溶液]。

蛋白質分離

  1. 向《DNA 分離》部分第 3 步獲得的上清液中添加 1.5 mL 異丙醇(每 1 mL 《RNA 分離》步驟 1 中使用的 LumiZol 試劑),通過翻轉管充分混合,并孵育 10分鐘在室溫下。

  2. 將管在 4°C 下以 12,000 × g 離心 10 分鐘。丟棄上清液。

  3. 將蛋白質沉淀重新懸浮在 2 mL 鹽酸胍/乙醇溶液(0.3 M 鹽酸胍于 95% 乙醇中)中。

  4. 將管在室溫下孵育 20 分鐘。

  5. 將管在 4 °C 下以 7,500 × g 離心 5 分鐘。丟棄上清液。

  6. 再重復步驟 3-5 兩次。

  7. 向蛋白沉淀中加入 2 mL 100% 乙醇,充分混勻,室溫孵育 20 分鐘。

  8. 將管在 4 °C 下以 7,500 × g 離心 5 分鐘。丟棄上清液。

  9. 將蛋白質沉淀風干 5-10 分鐘。

  10. 將蛋白質沉淀溶解在含有 SDS 的緩沖液中(例如,用于將蛋白質樣品加載到聚丙烯酰胺凝膠上的樣品緩沖液)。



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